溶菌酶是一种碱性球蛋白,广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中.哺乳动物的唾液,眼泪,尿,血浆及某些植物如萝卜,卷心菜中都含有溶菌酶.蛋白中溶菌酶含量最丰富.人们在食用鸡蛋时,蛋壳一般都弃作废物.其实蛋壳里带有残留蛋清,因此可以利用蛋壳来制备溶菌酶. 1.原料与试剂 新鲜或冰冻的带有残留蛋清的蛋壳;氯化钠,盐酸,氢氧化钠,氯化钙,碳酸钠,乙醇,醋酸钠(以上均为化学纯试剂),聚丙烯酸(分子量60000--80000). 2.制备方法 一.提取 将蛋壳用水冲洗干净后敲碎,放入搪瓷桶中,按蛋壳重量的70--80%加入1%的氯化钠溶液,搅拌均匀,用1:10盐酸调节溶液的PH值为6.0(用精密PH试纸测试).将搪瓷桶缓慢加热至约40度,保持1小时,并随时添加盐酸,使PH值维持在6.0,提取完毕后,用尼龙纱布过滤,收集滤液.滤渣可用1/2量的1%氯化钠溶液再提取一次,将两次滤液合并. 二.除杂 将滤液用20%--30%的醋酸调节PH值至4.6,在沸水中迅速加热到约80度,然后用冷水快速冷却到室温,沉淀10小时左右,再用尼龙纱布吊滤,除去杂蛋白,收集滤. 三.凝聚 用20%的氢氧化钠溶液调节滤液的PH值为6.0,一边搅拌,一边滴加10%的聚丙烯酸,加入量为滤液重量的20%--25%,静置约半小时,待凝聚物完全附着容器底部后,将上层清液倾去. 四.解离 在装有凝聚物的容器中,加少许蒸馏水,边搅拌边滴加少量纯碱溶液,使凝聚物溶解,并调节PH值至4.0.滴加50%的氯化钙溶液使溶菌酶离解,用布吊滤,收集滤液. 五.结晶 在滤液中加入少量氢氧化钠溶液,使PH值约为9.5,静置约6小时,用尼龙布过滤,分出清液,再加氯化钠至浓度为5%,精置4小时,得到粗结晶. 六.重结晶 粗结晶产品纯度不够,需进行重结晶.将粗结晶用PH值4.6的醋酸溶解,过滤除出不溶物,静置再结晶,经干燥后即得溶菌酶产品. 3.活性测定方法 一、配制底物溶液 取1克标记乙二醇化几丁于200毫升烧杯中,加入0.1摩尔/升,PH值4.5的醋酸----醋酸钠缓冲溶液100毫升,搅拌30分钟,离心后即得深蓝色透明的底物溶液. 二.配制溶菌酶标准溶液 在天平上准确称取60.00毫克生化试剂溶菌酶,用上述醋酸---醋酸钠缓冲溶液溶解并定溶至100毫升,此标准溶液中每毫升含0.6毫克溶菌酶. 三.绘制标准曲线 取6支试管,分别加入0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5毫升底物溶液,水浴(40度)预热.各加入0.5毫升溶菌酶标准溶液,依次加入1.0,0.9,0.8,0.7,0.6,0.5毫升醋酸---醋酸钠缓冲溶液,在40度下反应30分钟.再各加入酸乙醇(加醋酸于乙醇中使PH值为2.5)5毫升,离心分离后,取上层清液,在波长600纳米处测定吸光度,以吸光度对底物含量作图,绘制标准曲线. 四.样品测定 天平上准确称取一定量的溶菌酶样品,用醋酸---醋酸钠缓冲溶液溶解,配1.20毫克/毫升的样品溶液.移取底物溶液1毫升,40度下水浴预热,然后加入样品溶液0.5毫升,反应30分钟后,加入5毫升酸乙醇溶液.离心分离,取上层清液,在600纳米处测定吸光度值从标准曲线上可查出溶菌酶含量。 五、信息：北京市科海星火公司可以提供该技术的教学培训VCD，每套两盘共320元，附有鸡蛋黄提取蛋黄油技术。电话：010-68150495。 1、本站文章部分来源于互联网，转载是为了更好信息共享。如果侵犯了您的合法权益，请及时 通知我们，我们将第一时间删除。 2、中华英才实验室力倡IT文化，崇尚互联共享，欢迎各种媒体转载我们的原创文章，转载请注 明出处(包括作者)：中华英才实验室(www.chinahrlab.com) |
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